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當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章客戶成果分享 | 利用Micro-CT檢測小鼠樣本骨組織形態(tài)

客戶成果分享 | 利用Micro-CT檢測小鼠樣本骨組織形態(tài)

更新時間:2025-05-22點擊次數(shù):621
  浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院胡勁濤等教授在知網(wǎng)發(fā)布的《補充腎活躍血方對去勢骨質(zhì)疏松小鼠骨-血管形成偶聯(lián)調(diào)節(jié)作用的實驗研究》,探討了補充腎活躍血方對去勢骨質(zhì)疏松小鼠骨量及骨代謝的影響。
 
  實驗中應(yīng)用了布魯克Micro-CT儀器,三維重建了小鼠的骨組織形態(tài)圖像。
 
  引言
 
  絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是絕經(jīng)女性的常見隱匿健康威脅,特征為骨量減、結(jié)構(gòu)退變,骨折風(fēng)險大增。約半數(shù)絕經(jīng)女性患病,骨質(zhì)疏松性骨折率18%~23%,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。骨組織血管豐富,血管與骨形成緊密相關(guān),絕經(jīng)后骨組織血管減少。腎虛血瘀型多見,補充腎活躍血方(基于右歸飲加桃仁、紅花)療效明顯。
 
  本研究用補充腎活躍血方醫(yī)治去勢骨質(zhì)疏松小鼠,探討其對骨-血管形成及骨代謝的影響。
 
  實驗前瞻
 
  一、實驗儀器:
 
  實驗儀器JB-P5包埋機;RM2016病理切片機;Bruker Skyscan1272三維X射線顯微成像系統(tǒng);E100光學(xué)顯微鏡。
 
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Bruker Skyscan1272
 
  二、實驗準(zhǔn)備:
 
  實驗動物選取50只4~5周齡SPF級健康雌性ICR小鼠,在室溫(24±2)℃、濕度40%~60%、12 h晝夜交替照明的環(huán)境下飼養(yǎng)。
 
  三、動物分組:
 
  40只ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(10只)和去勢組(30只)。
 
  四、造模:
 
  去勢小鼠造模采用舒泰80 mg/kg腹腔注射麻醉及阿托品0.04 mg/kg肌注減少氣道分泌物。麻醉完成后剃除小鼠腹部毛發(fā),予以聚維酮消毒3次后鋪無菌巾。取腹部正中切口,逐層切開腹部肌肉及腹膜,沿輸卵管尋找到卵巢,摘除卵巢,縫合傷口。假手術(shù)模型行只切除卵巢周圍等量脂肪組織。
 
  五、術(shù)后處理與分組:
 
  去勢組小鼠行卵巢去勢手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)8周,隨機抽取3只小鼠證實骨質(zhì)疏松造模成功后,隨機取20 只成模小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組和中藥組,每組各10只。
 
  六、給藥:
 
  假手術(shù)組及模型組:等量生理鹽水灌胃。
 
  中藥組:補充腎活躍血方按小鼠給藥劑量換算得小鼠含生藥劑量為8.6 mg/kg,每日灌胃1次。
 
  七、樣本收集:
 
  干預(yù)8周后處死,收集樣本。
 
  八、實驗開展:
 
  進行Micro-CT、TRAP染色、免疫熒光染色( EM-CN、CD31) 、骨代謝指標(biāo)檢測。
 
  實驗過程
 
  一、Micro-CT檢測骨組織形態(tài)
 
  小鼠處死后,我們收集了股骨標(biāo)本,并仔細(xì)剔除了骨組織周圍的肌肉及肌腱組織。接著,我們使用了Bruker Skyscan1272三維X射線顯微成像系統(tǒng),按照設(shè)定的參數(shù)(電流140 μA、電壓70 keV、掃描厚度12 μm)對股骨遠(yuǎn)端進行了掃描。隨后,我們應(yīng)用了Bruker CTAn Micro-CT Software對骨組織形態(tài)進行了分析,重點關(guān)注的指標(biāo)包括:骨體積百分比(BV/TV)、小梁數(shù)量(Tb.N)以及小梁厚度(Tb.Th)。
 
  二、TRAP染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)量
 
  為了觀察破骨細(xì)胞的數(shù)量,我們對骨組織進行了脫鈣包埋處理,并制成了4 μm厚的石蠟切片。接著,我們進行了TRAP染色,并在顯微鏡下對破骨細(xì)胞的數(shù)量進行了觀察。為了更精確地分析結(jié)果,我們采用了Image J軟件進行了圖像分析。
 
  三、免疫熒光染色觀察股骨遠(yuǎn)端干骺端CD31、EMCN陽性表達
 
  我們首先對石蠟切片進行了脫蠟、抗原修復(fù)和封閉處理。然后,我們進行了一抗(CD31、EMCN)的4 ℃孵育過夜。第二天,我們進行了相應(yīng)的二抗孵育,并隨后采用了DAPI染液進行染色。在熒光顯微鏡下,我們進行了圖片采集,并再次采用了Image J軟件進行了圖像分析。
 
  四、骨代謝指標(biāo)檢測
 
  為了檢測骨代謝指標(biāo),我們收集了小鼠的腹主動脈血液,并通過200g離心力離心5分鐘來收集血清。接著,我們應(yīng)用了ELISA法檢測了骨形成指標(biāo)I型前膠原氨基末端肽(PINP)和骨吸收指標(biāo)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)。
 
  實驗結(jié)果
 
  一、各組小鼠骨組織形態(tài)的比較
 
  Micro-CT三維重建圖像顯示假手術(shù)組骨小梁較多,模型組骨小梁明顯減少,中藥組較模型組骨小梁增加。見圖1。定量分析結(jié)果顯示,假手術(shù)組骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)高于模型組和中藥組,而中藥組BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于模型組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
 
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圖1 各組小鼠脛骨Micro-CT三維重建橫斷面
 
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表1 各組小鼠Micro-CT檢測結(jié)果比較
 
  二、各組小鼠骨組織破骨細(xì)胞數(shù)量的比較
 
  骨組織TRAP染色及定量分析顯示,模型組TRAP陽性表達的數(shù)目高于假手術(shù)組和中藥組,而假手術(shù)組TRAP陽性表達的數(shù)目少于中藥組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2~圖3。
 
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圖2 各組小鼠TRAP染色結(jié)果(×40)
 
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圖3 各組小鼠破骨細(xì)胞定量分析比較
 
  四、各組小鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端CD31、EMCN陽性表達血管比較
 
  應(yīng)用CD31、EMCN對股骨遠(yuǎn)端干骺端進行熒光雙標(biāo)以檢測H血管的形成情況,結(jié)果顯示模型組干骺端H血管的比例相比假手術(shù)組明顯減少,中藥組干骺端H血管的比例較模型組增加,但低于假手術(shù)組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示補充腎活躍血方可以促進去勢骨質(zhì)疏松小鼠干骺端血管的形成。見圖4。
 
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圖4 各組小鼠干骺端骨組織 CD31 + EMCN 陽性面積比較
 
  五、各組小鼠血清骨代謝指標(biāo)比較
 
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表2 各組小鼠血清PINP、TRACP水平比較
 
  結(jié)果
 
  補充腎活躍血方可通過促進骨-血管形成,增加骨生成,減少骨吸收,提高去勢骨質(zhì)疏松小鼠的骨量。
 
  絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)的主要癥狀為腰背疼痛、骨畸形和乏力,中醫(yī)視其為“骨痿”“骨痹”,認(rèn)為與腎虛血瘀有關(guān)。女子絕經(jīng)后腎精虧虛,導(dǎo)致骨骼生長維系受影響,形成腎虛血瘀的惡性循環(huán)。補充腎活躍血是醫(yī)治PMOP的重要原則,補充腎活躍血方通過補充腎健骨、活躍血祛瘀達到醫(yī)治效果,研究顯示它能增加去勢骨質(zhì)疏松小鼠的骨量和骨小梁數(shù)量及厚度。
 
  近年來,研究發(fā)現(xiàn)H型血管與骨生長密切相關(guān),H血管減少是PMOP的危險因素。骨質(zhì)疏松女性血管內(nèi)皮生長因子表達水平較低,與骨形成指標(biāo)和骨密度正相關(guān)。促進H血管形成可以抑制破骨細(xì)胞功能,增加骨形成,預(yù)防和醫(yī)治PMOP。
 
  本文內(nèi)容來源:
 
  https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=ifIT5_n5_GcV1J_62qIHt2mBULHLQLCH4IWu6b64IT-78Jz0V-qsV_jEX9rQg4MkMVNFmmiGcMSeGcofaLVoYoFta95NF_7dxzSaw4pKVV3dVneVV9Stp1xYCEFSyzqDMOJ88t1_3boQq7t4WlNQ0GlGIknHwpDg9FafXnFJjp8J1zw64PRwHODibLrhrDzgM_vj567UCeOt8rqmHfOypw==&uniplatform=NZKPT
 

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